El verí de serp conté enzims que hidrolitzen els enllaços èster carboxílic.Els substrats per a la hidròlisi són fosfolípids, acetilcolina i acetat aromàtic.Aquests enzims inclouen tres tipus: fosfolipasa, acetilcolinesterasa i esterasa aromàtica.L'arginina esterasa en el verí de serp també pot hidrolitzar l'arginina o la lisina sintètica, però principalment hidrolitza els enllaços peptídics de proteïnes a la natura, de manera que pertany a la proteasa.Els enzims comentats aquí només actuen sobre substrats èster i no poden actuar sobre cap enllaç peptídic.Entre aquests enzims, les funcions biològiques de l'acetilcolinesterasa i la fosfolipasa són més importants i s'han estudiat completament.Alguns verins de serps tenen una forta activitat esterasa aromàtica, que pot hidrolitzar l'èster etílic de p-nitrofenil, l'acetat de naftalè a o P i l'èster d'indol.Encara es desconeix si aquesta activitat és produïda per un enzim independent o un efecte secundari conegut de la carboxilesterasa, i molt menys la seva importància biològica.Quan el verí d'Agkistrodon halys Japonicus va reaccionar amb p-nitrofenil etil èster i indol etil èster, no es van trobar els hidrolitzats de p-nitrofenol i indol fenol;Al contrari, si aquests èsters reaccionen amb el verí de la serp de la subespècie cobra Zhoushan i el verí de la serp Bungarus multicinctus, s'hidrolitzaran ràpidament.Se sap que aquests verins de cobra tenen una forta activitat colinesterasa, que pot ser responsable de la hidròlisi dels substrats anteriors.De fet, Mclean et al.(1971) van informar que molts verins de serps pertanyents a la família Cobra poden hidrolitzar l'èster etílic indol, l'èster etílic de naftalè i l'èster de butilnaftalè.Aquests verins de serps provenen de: cobra, cobra de coll negre, cobra de llavis negre, cobra daurada, cobra egípcia, cobra real, cobra mamba daurada, mamba negra i mamba de llavis blanc (D. aw encara coneix la serp de cascavell de rombola oriental
El verí de serp pot hidrolitzar l'èster etílic de metil indol, que és el substrat per determinar l'activitat de la colinesterasa en sèrum, però aquest verí de serp no mostra activitat colinesterasa.Això demostra que hi ha una esterasa desconeguda en el verí de cobra, que és diferent de la colinesterasa.Per entendre la naturalesa d'aquest enzim, cal més treball de separació.
1, Fosfolipasa A2
(I) Visió general
La fosfolipasa és un enzim que pot hidrolitzar el fosfat de gliceril.Hi ha 5 tipus de fosfolipasa a la natura, a saber, la fosfolipasa A2 i la fosfolipasa.
A. , fosfolipasa B, fosfolipasa C i fosfolipasa D. El verí de serp conté principalment fosfolipasa A2 (PLA2), alguns verins de serps contenen fosfolipasa B i altres fosfolipases es troben principalment en teixits animals i bacteris.La figura 3-11-4 mostra el lloc d'acció d'aquestes fosfolipases sobre la hidròlisi del substrat.
Entre les fosfolipases, la PLA2 s'ha estudiat més.Pot ser l'enzim més estudiat en el verí de serp.El seu substrat és l'enllaç èster a la segona posició del Sn-3-glicerofosfat.Aquest enzim es troba àmpliament en el verí de serps, el verí d'abelles, el verí d'escorpí i els teixits animals, i el PLA2 és abundant en quatre verins de serps familiars.Com que aquest enzim trenca els glòbuls vermells i provoca hemòlisi, també s'anomena "hemolisina".Algunes persones també anomenen lecitinasa hemolítica PLA2.
Ludeeke va descobrir per primera vegada que el verí de la serp pot produir un compost hemolític actuant sobre la lecitina mitjançant enzims.Més tard, Delezenne et al.va demostrar que quan el verí de cobra actua sobre el sèrum o el rovell de cavall, forma una substància hemolítica.Ara se sap que el PLA2 pot actuar directament sobre els fosfolípids de la membrana dels eritròcits, destruint l'estructura de la membrana dels eritròcits i provocant hemòlisi directa;També pot actuar sobre el sèrum o la lecitina afegida per produir lecitina hemolítica, que actua sobre els glòbuls vermells per produir hemòlisi indirecta.Tot i que el PLA2 és abundant a les quatre famílies de verins de serps, el contingut d'enzims en diversos verins de serps és lleugerament diferent.Serp de cascavell (C
El verí de serp només mostrava una activitat PLA2 feble.La taula 3-11-11 il·lustra la comparació de l'activitat PLA2 dels 10 verins principals de serps verinoses a la Xina.
Taula 3-11-11 Comparació de les activitats de la fosfolipasa VIII de 10 verins de serps a la Xina
Verí de serp
Alliberament de greix
àcid alifàtic,
Cjumol/mg)
Activitat hemolítica CHU50/^ g * ml)
Verí de serp
Alliberar àcids grassos
(^raol/mg)
Activitat hemolítica "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
onze
Micracephal ofis
cinc punt un zero
kalyspallas
8. 68
dos mil vuit-cents
gracilis
V, agut
7. 56
** #
Ophiophagus hannah
tres punt vuit dos
cent quaranta
Bnugarus fasctatus
7,56
dos-cents vuitanta
B. multicinctus
un punt nou sis
dos-cents vuitanta
Viper a russelli
set punt zero tres
T, mucroesquamat
un punt vuit cinc
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Separació i purificació
El contingut de PLA2 al verí de serp és gran i és estable a la calor, àcid, àlcali i desnaturalitzant, de manera que és fàcil de purificar i separar el PLA2.El mètode comú és dur a terme primer la filtració en gel sobre el verí brut, després realitzar una cromatografia d'intercanvi iònic i es pot repetir el següent pas.Cal tenir en compte que la liofilització de PLA2 després de la cromatografia d'intercanvi iònic no hauria de provocar l'agregació, perquè el procés de liofilització sovint augmenta la força iònica del sistema, que és un factor important que provoca l'agregació de PLA2.A més dels mètodes generals anteriors, també s'han adoptat els mètodes següents: ① Wells et al.② L'anàleg de substrat de PLA2 es va utilitzar com a lligand per a la cromatografia d'afinitat.Aquest lligand es pot unir a PLA2 en el verí de serp amb Ca2+.L'EDTA s'utilitza principalment com a eluent.Després d'eliminar el Ca2+, l'afinitat entre PLA2 i lligand disminueix i es pot dissociar del lligand.Altres utilitzen una solució orgànica al 30% o urea 6mol/L com a eluent.③ Es va realitzar una cromatografia hidrofòbica amb PheiiylSephar0SeCL-4B per eliminar la traça de PLA2 a la cardiotoxina.④ L'anticòs anti PLA2 es va utilitzar com a lligand per realitzar cromatografia d'afinitat sobre PLA2.
Fins ara, s'ha purificat una gran quantitat de verí de serp PLAZ.Tu et al.(1977) van enumerar el PLA2 purificat del verí de serp abans de 1975. En els darrers anys, s'han informat un gran nombre d'articles sobre la separació i purificació del PLA2 cada any.Aquí, ens centrem en la separació i purificació del PLA per part dels estudiosos xinesos.
Chen Yuancong et al.(1981) van separar tres espècies de PLA2 del verí d'Agkistrodon halys Pallas a Zhejiang, que es poden dividir en PLA2 àcid, neutre i alcalí segons els seus punts isoelèctrics.Segons la seva toxicitat, el PLA2 neutre és més tòxic, que s'ha identificat com a neurotoxina presinàptica Agkistrodotoxin.El PLA2 alcalí és menys tòxic i el PLA2 àcid gairebé no té cap toxicitat.Wu Xiangfu et al.(1984) van comparar les característiques de tres PLA2, incloent pes molecular, composició d'aminoàcids, N-terminal, punt isoelèctric, estabilitat tèrmica, activitat enzimàtica, toxicitat i activitat hemolítica.Els resultats van mostrar que tenien pes molecular i estabilitat tèrmica similars, però tenien diferències significatives en altres aspectes.Pel que fa a l'activitat enzimàtica, l'activitat enzimàtica àcida era superior a l'activitat enzimàtica alcalina;L'efecte hemolític de l'enzim alcalí sobre els glòbuls vermells de rata va ser el més fort, seguit de l'enzim neutre i l'enzim àcid amb prou feines hemolitzat.Per tant, s'especula que l'efecte hemolític de PLAZ està relacionat amb la càrrega de la molècula PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) han fet cristalls d'agkistrodotoxina.Tu Guangliang et al.(1983) van informar que un PLA tòxic amb un punt isoelèctric de 7.6 va ser aïllat i purificat a partir del verí de Vipera rotundus de Fujian, i les seves propietats físiques i químiques, la composició d'aminoàcids i la seqüència de 22 residus d'aminoàcids al N. -terminal es va determinar.Li Yuesheng et al.(1985) van aïllar i purificar un altre PLA2 del verí de Viper rotundus a Fujian.La subunitat del PLA2 * és 13 800, el punt isoelèctric és 10,4 i l'activitat específica és de 35/xnioI/miri mg。 Amb la lecitina com a substrat, el pH òptim de l'enzim és de 8,0 i la temperatura òptima és de 65 ° C. LD5 injectat per via intravenosa en ratolins.És de 0,5 ± 0,12 mg/kg.Aquest enzim té efectes anticoagulants i hemolítics evidents.La molècula tòxica de PLA2 consta de 123 residus de 18 tipus d'aminoàcids.La molècula és rica en cisteïna (14), àcid aspártic (14) i glicina (12), però només conté una metionina, i el seu N-terminal és un residu de serina.En comparació amb el PLA2 aïllat per Tuguang, el pes molecular i el nombre de residus d'aminoàcids dels dos isoenzims són molt similars, i la composició d'aminoàcids també és molt similar, però el nombre de residus d'àcid aspártic i prolina és una mica diferent.El verí de la serp cobra rei de Guangxi conté PLA2 ric.Shu Yuyan et al.(1989) van aïllar un PLA2 del verí, que té una activitat específica 3,6 vegades superior a la del verí original, un pes molecular de 13000, una composició de 122 residus d'aminoàcids, un punt isoelèctric de 8,9 i una bona estabilitat tèrmica.A partir de l'observació al microscopi electrònic de l'efecte del PLA2 bàsic sobre els glòbuls vermells, es pot veure que té un efecte evident sobre la membrana dels glòbuls vermells humans, però no té cap efecte evident sobre els glòbuls vermells de la cabra.Aquest PLA2 té un efecte de retard evident sobre la velocitat electroforètica dels glòbuls vermells en humans, cabres, conills i conillets d'índies.Chen et al.Aquest enzim pot inhibir l'agregació plaquetària induïda per ADP, col·lagen i àcid araquidònic sòdic.Quan la concentració de PLA2 és de 10/xg/ml ~ lOOjug/ml, l'agregació plaquetària s'inhibeix completament.Si s'utilitzen plaquetes rentades com a materials, PLA2 no podria inhibir l'agregació a la concentració de 20 Mg/ml.L'aspirina és un inhibidor de la ciclooxigenasa, que pot inhibir l'efecte de la PLA2 sobre les plaquetes.El PLA2 pot inhibir l'agregació plaquetària mitjançant la hidrolització de l'àcid araquidònic per sintetitzar el tromboxà A2.La conformació de la solució de PLA2 produïda pel verí Agkistrodon halys Pallas a la província de Zhejiang es va estudiar mitjançant dicroisme circular, fluorescència i absorció UV.Els resultats experimentals van mostrar que la conformació de la cadena principal d'aquest enzim era similar a la del mateix tipus d'enzim d'altres espècies i gèneres, la conformació de l'esquelet tenia una bona resistència a la calor i el canvi estructural en l'entorn àcid era reversible.La combinació de l'activador Ca2+ i l'enzim no afecta l'entorn dels residus de triptòfan, mentre que l'inhibidor Zn2+ fa el contrari.La manera en què el valor de pH de la solució afecta l'activitat enzimàtica és diferent dels reactius anteriors.
En el procés de purificació de PLA2 del verí de serp, un fenomen evident és que un verí de serp conté dos o més pics d'elució de PLA2.Aquest fenomen es pot explicar de la següent manera: ① per l'existència d'isoenzims;② Un tipus de PLA2 es polimeritza en una varietat de mescles de PLA2 amb diversos pesos moleculars, la majoria de les quals estan en el rang de 9 000 ~ 40 000;③ La combinació de PLA2 i altres components de verí de serp complica PLA2;④ Com que l'enllaç amida del PLA2 està hidrolitzat, la càrrega canvia.① I ② són comuns, amb només unes poques excepcions, com ara PLA2 al verí de serp CrWa/w
Hi ha dues situacions: ① i ②.La tercera condició s'ha trobat a PLA2 en el verí de les serps següents: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, escurçó palestí, escurçó de sorra i terrible serp de cascavell km。
El resultat del cas ④ fa que la velocitat de migració del PLA2 canviï durant l'electroforesi, però la composició d'aminoàcids no canvia.Els pèptids es poden trencar per hidròlisi, però generalment encara estan units per enllaços disulfur.El verí de la serp de cascavell de l'est conté dues formes de PLA2, anomenades PLA2 tipus a i tipus p respectivament.La diferència entre aquests dos tipus de PLA2 és només un aminoàcid, és a dir, la glutamina en una molècula de PLA2 es substitueix per àcid glutàmic a l'altra molècula de PLA2.Tot i que la raó exacta d'aquesta diferència no està clara, generalment es creu que està relacionada amb la desaminació de PLA2.Si el PLA2 del verí de l'escurçó palestí es manté calent amb el verí cru, els grups finals de les seves molècules enzimàtiques es convertiran en més que abans.De C, PLA2 aïllat del verí de serp té dos terminals N diferents, i el seu pes molecular és de 30.000. Aquest fenomen pot ser causat pel dímer asimètric de PLA2, que és similar al dímer simètric format per PLA2 en el verí de la serp de cascavell de l'est de diamant. i la serp de cascavell de l'oest diamant.La cobra asiàtica es compon de moltes subespècies, algunes de les quals no tenen una classificació molt definida.Per exemple, ara es reconeix el que abans s'anomenava la subespècie Cobra del Caspi Exterior
S'ha d'atribuir a la cobra del mar Càspi exterior.Com que hi ha moltes subespècies i es barregen, la composició del verí de serp varia molt a causa de les diferents fonts, i el contingut d'isoenzims PLA2 també és elevat.Per exemple, el verí de cobra
Es van trobar almenys 9 tipus d'isoenzims PLA2 d'espècies r ^ ll i es van trobar 7 tipus d'isoenzims PLA2 al verí de la subespècie de cobra Caspian.Durkin et al.(1981) van estudiar el contingut de PLA2 i el nombre d'isoenzims en diferents verins de serps, inclosos 18 verins de cobra, 3 verins de mamba, 5 verins d'escurçó, 16 verins de serps de cascavell i 3 verins de serps de mar.En general, l'activitat PLA2 del verí de cobra és alta, amb molts isoenzims.L'activitat PLA2 i els isoenzims del verí d'escurçó són mitjans.L'activitat PLA2 del verí de mamba i el verí de la serp de cascavell és molt baixa o no té activitat de PLA2.L'activitat PLA2 del verí de la serp marina també és baixa.
En els darrers anys, no s'ha informat que el PLA2 en el verí de serp existeixi en forma de dímer actiu, com la serp de cascavell rombofora oriental (el verí de serp C. conté PLA2 tipus a i tipus P, tots dos compostos per dues subunitats idèntiques). , i només la dimerasa té
Activitat.Shen et al.també va proposar que només el dímer de PLA2 del verí de serp és la forma activa de l'enzim.L'estudi de l'estructura espacial també demostra que el PLA2 de la serp de cascavell de diamant occidental existeix en forma de dímer.Compost piscívor
Hi ha dos PLA ^ Ei i E2 diferents de verí de serp, en els quals 仏 existeix en forma de dímer, el dímer és actiu i el seu monòmer dissociat és inactiu.Lu Yinghua et al.(1980) van estudiar més a fons les propietats físiques i químiques i la cinètica de reacció d'E. Jayanthi et al.(1989) van aïllar un PLA2 bàsic (VRVPL-V) del verí de l'escurçó.El pes molecular del monòmer PLA2 és de 10.000, que té efectes letals, anticoagulants i edema.L'enzim pot polimeritzar polímers amb diferents pesos moleculars sota la condició de PH 4,8, i el grau de polimerització i el pes molecular dels polímers augmenten amb l'augment de la temperatura.El pes molecular del polímer generat a 96 ° C és de 53 100, i l'activitat PLA2 d'aquest polímer augmenta en dos
Hora de publicació: 18-nov-2022